Bejelentkezés
 Fórum
 
 
Témakiírás
 
A tumoros progresszió génexpressziós térképének kialakítása a tumorok individuális viselkedésének predikciójára

TÉMAKIÍRÁS

Intézmény: Semmelweis Egyetem
elméleti orvostudományok
Patológiai tudományok Doktori Iskola

témavezető: Tímár József
helyszín: SE II.sz. Patológiai Intézet
helyszín rövidítés: SE


A kutatási téma leírása:

A klinikai onkológia fejlődése felgyorsult, ami két tényezőnek köszönhető. Egyrészt a klasszikus kemoterápiák egyre hatékonyabb kombinációkban kerülnek alkalmazásra az egyes daganatféleségek esetében, másrészt a molekuláris biológiai ismereteket kezdték felhasználni, az egyes daganatok hatékonyabb terápiájának kialakítására. Ennek ellenére ez a fejlődés nem elég gyors és ez azért van, mert a terápiák nagy többsége a primer daganaton, ill. a lokálisan terjedő tumoron hatékony, ugyanakkor a hatékonyság drámai módon lecsökken a progresszió késői stádiumában az áttétes betegség esetében. Bár az áttétképződés molekuláris mechanizmusának körvonalai és alapjai évek óta tisztázottnak látszanak, nyilvánvaló, hogy ennek konkrét molekuláris mechanizmusa az egyes daganatféleségek esetében más és más, és az apró részleteknek igen nagy jelentősége van a betegség kimenetele szempontjából.(1) Magyarán szólva, minden egyes daganatféleség esetében a folyamat molekuláris részleteit tisztázni kell ahhoz, hogy hatékony diagnosztikus és prognosztikus terápiás protokollokat építhessünk erre. A kérdés vizsgálatához, tanulmányozásához és megértéséhez nagy segítséget adhat a globális genomikai megközelítés, amikor a tumorprogresszió folyamatának különböző szakaszait, stádiumait vizsgáljuk, ahol a génexpressziós változásokat teljes humán genomra kiterjesztve próbáljuk analizálni. Számos ilyen típusú vizsgálat történt a közelmúltban, de az eredmények igen ellentmondóak. Az ellenmondások egyik oka a metodikák összehasonlíthatatlansága, ill. sajátosságában rejlik. Az eredmények kiértékelése matematikai-, statisztikai analízissel történhet, amelynek biológiai jelentősége nehezen megítélhető. A másik probléma a vizsgálatokkal az, hogy a tumor progresszió egyes stádiumait nagyon széles értelemben használják nem megfelelően validált körülmények között. A végeredmény az, hogy a vizsgálatok egy jelentős része majdhogynem diszkvalifikálta a humán génexpressziós módszer alkalmazását, hisz ugyanarra a daganatra nézve is igen ellentmondó eredmények, ún. génexpressziós mintázatok láttak napvilágot. Jelen pályázat esetében két daganatféleségre koncentrálunk, ez pedig a malignus melanoma, ill. a fej-nyaki daganat. Választásunk oka az, hogy a malignus melanoma klinikai menedzselése a progresszió előrehaladtával egyre inkább lehetetlenné válik, hatékony terápiával nem rendelkezünk. Nagyon fontos lenne megismerni azt a génexpressziós mintázatot, amely felelős ezen folyamat előrehaladásáért. Hogy a melanomát válasszuk annak az is oka, hogy a melanoma igen kicsiny, néhány milliméteres daganat esetén már nagy valószínűséggel áttétképző hajlamú, ami a szolid daganatok között igen különleges státust biztosít.
Másik modellként a fej-nyaki daganatokat választjuk, hiszen hazánkban az elmúlt évtizedekben drámai módon megnőtt az előfordulásuk gyakorisága és bár relatíve egyszerű progressziós képességgel rendelkező daganattal állunk szemben, mégis az öt éves túlélés igen rossz a jelentősen fejlődő kemoterápia, radioterápia és sebészi terápia kombinációjának alkalmazásával is.
Melanoma esetében számos DNS microarray vizsgálat történt, részben különböző áttétképességű sejtvonalakon, részben metasztázis modelleken, kisebb részben klinikai mintákon.(2) Nagyon különböző génexpressziós profilokat tárt fel, amelyek között átfedés nagyon kevés. Ezek között a NOTCH-2 és a WNT5A transzkripciós fatorok szerepe a TOPO2A és CDC2 proliferáció asszociált gének a membrán receptorok közül az FGF receptor és az EphA3, az adhéziós molekulák közül az N-kadherin és a 3-integrin ill. a syndecan-4 szerepe tűnik egyértelműnek. Azonban meg kell jegyezni, hogy ezen közös génexpressziós profil tesztelése egyáltalán nem történt meg klinikai körülmények között. Saját korábbi vizsgálataink a humán melanoma áttétképző képessége szempontjából több gént azonosítottak, nem génexpressziós profil meghatározással, ezek között heparanszulfát proteoglikánok kiemelkedő szerepét igazoltuk, elsősorban a CD44v3 spice-variánst. A 3 integrinre vonatkozó vizsgálataink arra utaltak, hogy az v, ill.IIb láncok közül meghatározó szerepe feltehetőleg a trombocita jellegű IIb ektopiás expressziójának van, aminek eredménye egy konstitutívan aktivált integrin szignalizációs útvonal. A melanoma progressziója szempontjából nagyon fontos lehet a AMF-receptor expressziója, az autokrin motilitási kör kialakulása, és ennek a szignalizációs útvonalnak az aktiváltsága, amely proteinkináz-függő.(1) Az előző ETT-periódus vizsgálatai két területen is előrelépést hoztak. Felhívták a figyelmet a CMET-onkogén fokozott progressziójára melanomában, melyet más laboratóriumok is már korábban megfigyeltek. A magunk részéről azonban igazoltuk, hogy ennek jelentősége a melanoma motilitásában és áttétképző képességében van. Másrészről igazoltuk, hogy egy másik tirozinkináz aktivitású onkogén az EGF-receptor1 is fokozottan expresszálódik melanomákban, és szemben a c-met onkogénnel, amely vad-típusú formában jelentkezik, az EGF receptor melanomában mutáns formában van jelen, a mutáció pedig elsősorban az extracelluláris domént, annak is ligand-kötő szakaszait érinti, és ez vezet ezen tirozinkináz fokozott aktivitásához, amely az apoptotikus folyamatok befolyásolása mellett szintén a melanoma motilitását befolyásolja, és így az áttétképzésben van szerepe. Előzetes microarray vizsgálataink pedig arra utaltak, hogy az áttétképző képességű humán melanoma sejtvonalakban a 3 integrin egyik szignalizációs partnere a 3-endonexin fokozott expressziója fontos szerepet játszhat, a csökkent expressziót mutató gének között az MMP inhibitor TIMP-3, a plazminogén aktivátor receptor uPAR, ill. a TRAIL szerepeltek.(3) A fej-nyaki daganatok esetében korábbi vizsgálatok megerősítették az EGF receptor fokozott expressziójának jelentőségét a progressziós folyamatban, és az ehhez csatlakozó proliferációt szabályozó mechanizmusok közül a ciklin-D1 fokozott expressziója tűnt konzekvensnek. A progresszió szempontjából kulcsfontosságú géneket vizsgálva a kathepszin-B és L proteáz-rendszer ill. MMP2 fokozott expressziója tűnt fel számos rendszerben. A migráció szempontjából pedig a CMET onkogén fokozott expressziója tűnt fontosnak. Feltűnő volt a fej-nyaki daganatok progressziójában az apoptotikus készség-csökkenésében a FASL szerepe, és az extracelluláris matrix interakciók szempontjából pedig az E-kadherin elvesztése, ill. az 64 integrin fokozott expressziója megváltozott funkcióval valamint a CD44v6v3 metasztázis gén expressziója. (4) Saját korábbi vizsgálatainkban Superarray-vel folytatott 100 metasztázis gén expressziós profilját meghatározva, gége és hipofarinx rákok összehasonlítása során azt a meglepő eredményt kaptuk, hogy nagyon kevés olyan gén van, amely mindkét daganat esetében a progresszióban releváns hatású lehet. A közös gének között a DCC tumorszuppresszor gén, ill. a CFOS onkogén mellett az MT1 MMP és cisztein proteáz inhibitor cisztatin-C valamint a CD31 endotél-marker expressziója volt jellemző. Feltűnő volt, hogy a laringeális daganatok esetében 21 gén jellemezte az expressziós profilt, amelyek között az MMP1 és kathepsin-B proteázok, az oszteopontin, és az 6-integrin jelent meg, valamint az API5 apoptózis inhibitor elvesztését észleltük. Hipofaringeális daganatokban a kaszpáz-8 a CFES onkogén eltűnése volt jellemző.(5) Mindezen tanulságok alapján azt gondoljuk, hogy célszerű olyan génexpressziós vizsgálatokat végezni, ahol megfelelő kísérleti körülmények között, modellezni tudjuk az adott humán daganat áttétképző képességét, el tudjuk választani a stromális expressziós mintázatot a tumorsejtek expressziós mintázatától és a kapott eredményeket megfelelő számú klinikai anyagon validálni tudjuk.
Humán melanoma metasztatikus génexpressziós génprofiljának meghatározása egérmodellben.
A megközelítés értelme az, hogy a klinikai körülmények között általában a primer tumorszövetet tudjuk vizsgálni, ritkán van esélyünk metasztatikus szövetet vizsgálni, és tulajdonképpen a prognosztikus patológia a primer tumorból próbálja megjósolni a daganat kimenetelét. Ezt próbáljuk meg modellezni ezen egérmodell-rendszerben is. SCID egér-modellünk abból a szempontból különleges, hogy spontán áttétképzés csak az újszülött egerekben történik, felnőtt állatban csak primer tumor keletkezik a szubkután oltás helyén, áttét nem képződik. A vizsgálatokhoz három genetikailag eltérő humán melanoma sejtvonalat kívánunk használni, melyek mind metasztatikus képességgel bírnak, melyeket újszülött, ill. felnőtt SCID egerek bőre alá oltjuk. A primer tumorokból RNS-t izolálunk és meghatározzuk egér, ill. humán oligoarray (22 illetve 45K) segítségével a tumorok (humán), ill. a tumor stroma (egér) expressziós mintázatát, ún. metasztatikus, ill. nem metasztatikus körülmények között. Mindhárom sejtvonal estében 3-3 parallel anyagot vizsgálunk, a génexpressziós eltérések kiértékelésekor minimálisan kétszeres expressziós eltérést fogunk szignifikánsnak tekinteni. Az eltérően expresszálódó géneket kvantitatív PCR-ral ill. Taqman-kártyával igyekszünk ellenőrizni. Ezen kísérletekkel párhuzamosan saját humán tumorbankunkból nagyszámú melanomás esetet fogunk kiválasztani, amelyek 5 éves kimenetele már ismert és nem metasztatikus, ill. metasztatikus képességgel bíró primer daganat-csoportokat fogunk elkülöníteni: az anyagból szöveti microarray-t alakítunk ki. 20-20 metasztatikus illetve nem metasztatikus primer melanómából lézer-mikrodisszekcióval tumor/stroma RNS-t izolálunk.
Humán fej-nyaki rákok metasztatikus génexpressziós mintázatának meghatározása egérmodellben.
Három genetikailag különböző metasztatikus képességgel bíró fej-nyaki rák sejtvonalat választunk, amelyeket perioralisan oltunk be újszülött és felnőtt egerekbe. A metasztatikus, ill. nem metasztatikus primer tumorokat 3-4 hét múlva távolítjuk el, ezekből RNS-t izolálunk és a melanomás modellhez hasonlóan egér, ill. humán oligoarray-vel vizsgáljuk meg az eltérően expresszálódó géneket: minimálisan kétszeres expressziós eltérést tekintünk értékelhetőnek valamennyi sejtvonal esetében. Az adatokat kvantitatív PCR-ral ill. Taqman kártya segítségével fogjuk validálni. Ezzel párhuzamosan nagyszámú fej-nyaki rákból álló szövetbankunkból szöveti microarray-t alakítunk ki, ahol a betegség három éves lefolyása ismert és a metasztatikus, nem metasztatikus csoportot fogunk kialakítani.
20-20 metasztatikus és nem-metasztatikus fejnyaki primer tumorból daganatszövetet és stromát izolálunk mikrodisszekció segítségével és RNS-t izolálunk, mely minőségét ellenőrizzük.
Metasztatikus melanoma és fej-nyaki daganat expressziós mintázat validálása primer bőrmelanoma és fejnyaki rákos mintákon.
A vizsgálatokat olyan oligo-makroarray segítségével végezzük amelyet SpotBot ArrayIT készülékkel készítünk, amelyen azokat a géneket helyezzük el, amelyeket az egérkísérletekben határoztunk meg. A melanóma és fejnyaki mintákon meghatározzuk a tumor és stroma expressziós mintázatát. Az eltérően expresszáló géneket kvantitatív PCR vizsgálattal is validáljuk. Azon esetekben, amikor az eltérően expresszálódó gének terméke ellen kereskedelmi forgalomban lévő antitest is rendelkezésünkre áll, immunhisztokémiai ellenőrzést végzünk, nagyszámú esetből álló szöveti microarray-k segítségével. Az egyes „metasztázis markerek” prognosztikus erejét biostatisztikai módszerekkel határozzuk meg. Ezen vizsgálatok eredményeként melanóma és fejnyaki rák pronosztikus makrochip-et kívánunk létréhozni illetve szabadalmaztatni.
Várható eredmények
Vizsgálatainktól azt várjuk, hogy a különleges állatkísérleti modellünk segítségével olyan relatíve kisszámú genetikai ujjlenyomatot tudunk meghatározni humán melanomán és fej-nyaki rákban, amely klinikai relevanciával bír. Korábbi vizsgálatok alapvető kritériumokat nem tartottak be, mert ugyan eltérő áttétképességű rendszereket használtak, de arra nem figyeltek, hogy az adott modell egyedi genetikai sajátosságai ne domináljanak. Feltehetően ezért van az, hogy a különböző modellrendszerekben kapott génexpressziós profilok annyira eltérőek. Mi ugyanolyan körülmények közé visszük azt a három eltérő genetikai hátterű sejtvonalat mindkét daganatféleség esetében, és azt várjuk, hogy azok a gének, amelyek közösek a három vonalban, általánosíthatók klinikai körülmények között is. Másik hibája a korábbi vizsgálatoknak a stroma és a daganatsejt expressziós profiljának nem megfelelő elválasztása. Ez elsősorban a klinikai minták esetében jelentős hiba, amelyet úgy kísérlünk megelőzni, hogy meghatározzuk a kísérleti modellünkben a tumorexpressziós profilt és külön a tumoros stroma expressziós profilját a metasztatikus, és nem metasztatikus körülmények között. Humán körülmények között mind a stroma, mind a humán tumor humán gén expressziós profilt mutat, azonban itt a lézermikrodisszekció segítségével el tudjuk választani egymástól a tumorszövetet a stromától. Így lehetőségünk van a progresszió szempontjából fontos tumorsejt-asszociált és stroma-asszociált expressziós profil meghatározására. Végül az adatainkat Taqman ill. QPCR validálásnak vetjük alá és a kereskedelmi forgalomban lévő antitestek felhasználásával szöveti microarray segítségével ellenőrizzük, hogy a metasztatikus génexpressziós profilok közül mely gének, ill. termékeik használhatók esetleg ún. prognosztikus markerként is a továbbiakban egyszerű immunhisztokémiai vizsgálatok segítségével. Azt gondoljuk, hogy az általunk használt protokoll szerinti kísérleti vizsgálati rendszer mind a melanomák, mind a fej-nyaki rákok esetében jelentős előrelépés lehet a progresszió folyamatának megismerésében és olyan hasznos genomikai információk kigyűjtésében, amelyek klinikai relevanciával bírnak.

felvehető hallgatók száma: 3

Jelentkezési határidő: 2016-10-30

 
Minden jog fenntartva © 2007, Országos Doktori Tanács - a doktori adatbázis nyilvántartási száma az adatvédelmi biztosnál: 02003/0001. Program verzió: 1.2318 ( 2016. XI. 26. )