Login
 Forum
 
 
Thesis topic proposal
 
Károly Acsai
A Ca mikrodomének szerepének vizsgálata a Na/Ca-exchanger gátlás mint potenciális pozitív inotróp és antiaritmiás farmakológiai beavatkozás celluláris elektrofiziológiájá

THESIS TOPIC PROPOSAL

Institute: University of Szeged
theoretical medicine
Graduate School of Multidisciplinar Medical Scienses

Thesis supervisor: Károly Acsai
Location of studies: Univ. Szeged, Faculty of Medicine, Department of Pharmacology and Pharmacotherapy
Abbreviation of location of studies: ÁOK


Description of the research topic:

1. Háttér

A Na/Ca-exchanger (NCX) ígéretes támadáspont a szívelégtelenség kezelésében

A szívelégtelenség gyakori, súlyos és progresszív betegség, melynek előfordulása folyamatosan növekszik az USA-ban és Európában is (Redfield 2002). Az USA-ban évente több mint 280 ezer ember haláláért a szívelégtelenség felelős, és évente több mint 500 ezer új esetet diagnosztizálnak. Mivel a betegség progresszív természetű, a tünetmentes vagy csak enyhe balkamrai diszfunkciós pácienseket is veszélyezteti a további romlás és az 5 éven belüli halál lehetősége (Wang et al. 2003).
A Na/Ca-exchanger (NCX) kulcsszerepet játszik a szívizomsejtek normális Ca-háztartásának fenntartásában (Bers 2000). Az excitáció-kontrakció kezdetén a sejtekbe beáramló Ca eltávolításának fő útvonalát az NCX forward irányú működése biztosítja, az NCX reverz irányú működése pedig hozzájárul a Ca-indukálta Ca-release hatékonyságához.
Az utóbbi évek kutatásai arra utalnak, hogy az NCX farmakológiai modulációja ígéretes megközelítés lehet különböző szívbetegségek kezelésében, beleértve a szívelégtelenséget is. (Kamimura et al. 2012, Sipido et al. 2006, Lee et al. 2005). Számos közlemény szerint szívelégtelenségben a szarkoplazmatikus retikulum Ca-mal való feltöltődése károsodik, ugyanakkor a sejtből való Ca eltávolítás fokozódik az NCX fokozott expressziója miatt (O’Rourkey 2008). Ez vezetett annak az elméleti lehetőségnek a megfogalmazásához, hogy az NCX-re irányuló támadásponttal a károsodott Ca háztartás javítható lenne (Hobai et al. 2004). Ezt az elméleti lehetőséget azóta kísérleti eredmények is alátámasztották, melyek szerint a forward NCX gátlása valóban pozitív inotróp hatást eredményez (Acsai et al. 2007, Ozdemir et al. 2008). Más közlemények azonban nem tudták igazolni ezeket az eredményeket, tehát az NCX gátlók lehetséges pozitív inotróp hatása tekintetében a szakirodalom nem egységes (Birinyi et al. 2008, Takahashi 2004).

A funkcionális Ca-mikrodomének szerepe a celluláris Ca-homeosztázisban

A szívizomsejtek kiterjedt transzverzális tubulus rendszerrel rendelkeznek, ami a hatékony és szinkronizált Ca indukálta Ca release alapvető anatómiai alapját képezi (Eisner at al. 2000). A t-tubulus membránok és a szarkoplazmatikus retikulum szemközti, junkcionális régiója közötti szűk teret diadikus térnek vagy szubszarkolemmális régiónak nevezzük (Bers 2000). A szívciklusok kezdetén a Ca release következtében ebben a régióban egy funkcionális Ca mikrodomén jön létre a Ca ionok lassú diffúziója, disszipációja miatt. Egyre több kísérleti eredmény utal arra, hogy az ezen régióban expresszált NCX speciális szerepet játszik a Ca indukált Ca release folyamatban, melynek következtében a globális Ca-háztartásban is fontos regulációs szerepe van (Despa et al. 2012). Az NCX, a Na/K-pumpa és a Na- és Ca-áramok egymásra hatása ebben a régióban, tehát a t-tubulus membránok környezetében speciális ionális környezetet hoz létre, amely a Ca indukálta Ca release szabályozása révén felerősített módon szabályozza a teljes celluláris Ca tartalmat és a szívizomsejt inotróp állapotát (Swift et al. 2010). Ennek értelmében az ezen régióban expresszált NCX modulációja nem várt következményekkel járhat a globális celluláris Ca-háztartásban, tehát ez a jelenség részben felelős lehet az NCX-gátlásra adott inotróp válasz különböző kísérleti modellekben észlelt eltéréseiben. Ezt a kérdéskört ilyen szempontból azonban még nem vizsgálták a szakirodalomban.


2. A PROJEKT SPECIFIKUS CÉLKITŰZÉSEI

Kutatási projektünk a szívizomsejtek t-tubulus membránjában expresszált regulációs funkciójú NCX farmakológia modulálásának jelentőségét igyekszik tisztázni, elsősorban az NCX-gátlás inotróp hatásainak problémakörében. Intézetünk különlegesen előnyös helyzetben van az NCX-gátlás tanulmányozásában, mivel a régebbi, általánosan használt NCX-gátlók (KB-R7943, SEA0400) mellett a legújabb inhibítorokkal is rendelkezünk (ORM10103, ORM10962), melyeket az Orion gyógyszercég (Orion Pharma, Finland) bocsátott rendelkezésünkre.
Mivel a t-tubulus membránokban expresszált NCX intakt sejtekben nem vizsgálható izoláltan, ezért a projekt keretében részproblémákat fogalmazunk meg, melyek az NCX gátlók tulajdonságainak illetve az NCX gátlás komplex elektrofiziológiájának egy-egy aspektusára vonatkoznak. Célul tűzzük ki néhány, a szakirodalomban vitatott kérdés tisztázását, amelyek a jelenleg leggyakraban alkalmazott (KB-R7943, SEA0400) és néhány új NCX gátló (ORM vegyületek) hatékonyságára vonatkoznak. Vizsgálni fogjuk az intracelluláris ionösszetétel hatását az inhibítorok hatékonyságára, az inhibítorok irányszelektivitását és a szubszarkolemmális Ca mikrodomének speciális ionális összetételének szerepét az NCX gátlás következményeiben. Továbbá vizsgálni kívánjuk a Ca mikrodomének dezorganizációjának moduláló hatását az NCX inhibítorok által kifejtett inotróp hatásokra.

2/ I. Az NCX-gátlók hatékonyságának függése az intracelluláris ionkoncentrációktól

A SEA0400-zal végzett kísérletek arra utalnak, hogy az NCX-gátlás hatékonysága erősen függ az intracelluláris Na-szinttől (Lee et al. 2004). Ezeket a kísérleteket nem emlős szívizomsejteken, hanem Xenopus oocitákkal végezték, extrém magas intracelluláris Na szint mellett (100mM), ennek ellenére a Na-függő gátlás és az NCX Na függő inaktivációjának fokozása mint az NCX gátlás mechanizmusa, széleskörűen elfogadottá vált az NCX-kutatók körében. Az NCX Na függő inaktivációjának jelensége intakt szívizomsejtekben azonban erősen megkérdőjelezhető, hiszen szívizomsejtekben a patológiás esetekben mérhető legmagasabb Na koncentráció is messze elmarad az 50-100 mM-os nagyságrendtől (Despa et al. 2002). Ezért az NCX Na-függő gátlásának lehetősége intakt szívizomsejtekben valójában még igazolásra vár.
Egy KB-R7943-mal végzett tanulmány szerint az intracelluláris Ca befolyásolja a KB-R7943 NCX-gátló hatását (Watano and Kimura, 1998). A SEA0400 esetében kutatócsoportunk kimutatta, hogy NCX-gátló hatása inverz Ca-függést mutat (Birinyi et al. 2008). Intakt Ca-háztartás esetén azonban ezt a jelenséget még nem igazoltuk.
Ezen témakörnek az a jelentősége, hogy az NCX-gátlás bárminemű függése az intracellulárs Na- és Ca szintektől meghatározhatja, hogy milyen mértékü aktuális NCX-gátlás alakul ki a szívizomsejtek egyes szubcelluláris régióiban. Ennek értelmében a t-tubulusok mentén, ahol a szívciklus kezdetén magasabb a Ca- és Na-szint, az NCX gátlás mértéke eltérő lehet a sejtfelületi membránban expresszált NCX gátlásához képest. Mivel a t-tubulus membránban expresszált NCX-nek különleges szerepe van a Ca-indukálta Ca-release folyamatában, az itt levő NCX eltérő farmakológiai modulációja felerősített módon növelheti, vagy csökkentheti a globális Ca-háztartás NCX-gátlásra adott válaszát. Ezért ebben a szakaszban olyan kísérleteket fogunk végrehajani, amelyekkel tisztázni kívánjuk a Na- és Ca-ionok lehetséges moduláló hatását az NCX farmakológiai (KB-R7943, SEA0400 és ORM-vegyületek) gátlásában.


2/ II. Az NCX-gátlók traszportmód-szelektivitásának tisztázása

A KB-R7943 által mutatott szelektív reverz NCX gátlás előnyös tulajdonság a különböző patológiás folyamatokban kialakuló Ca-túltelítődés kivédésére (Amran et al. 2003, Birinyi et al. 2005). A többi NCX gátló esetén azonban ez a kérdés még nem kellően felderített. Teljes sejtes patch clamp konfigurációban ramp feszültséggel kiváltott NCX-áramon a SEA0400 azonos hatékonysággal gátolja a reverz és a forward NCX-et (Tanaka et al. 2002, Birinyi et al. 2005).
Ezzel szemben inside-out giant patch konfigurációban, ionkoncetráció-lépésekkel aktivált NCX esetén a SEA0400 forward irány gátlására mutatott IC50 értéke sokkal nagyobbnak bizonyult a reverz mód IC50értékéhez képest, ami az alacsonyabb koncentrációk esetén viszonyleg szelektív reverz mód gátlást eredményez.
Ezen kérdéskör kulcsfontosságú, hiszen a transzportmód-szelektivitás meghatározhatja az egyes NCX gátlók használhatóságát a különböző szívbetegségek (és más betegségek) esetén. Egy NCX-gátló eredő hatása nemcsak a reverz és forward mód Ca-háztartásban betöltött relatív szerepétől függ, hanem az inhibítor által kifejtett irányszelektív gátlástól is. A reverz mód gátlása előnyös a Ca-túltelítéssel járó esetekben (pl iszkémia-reperfúzió), míg a forward mód gátlása hasznos lehet gyengült Ca-ciklus esetén (szívelégtelenség). Ebben a szakaszban tehát az NCX-gátlók esetleges transzportmód-szelektivitását fogjuk szisztematikus módon vizsgálni és összehasonlítani.

2/ III. A t-tubulusokkal kapcsolatos szubszarkolemmális Ca-mikrodomének szerepe az NCX gátlás következményeiben

A t-tubulus rendszer strukturális alapot szolgáltat a szinkronizált Ca-felszabaduláshoz, ami elengedhetetlen a hatékony sejtkontrakciók létrejöttéhez. A t-tubulusok szerepének vizsgálatához egyszerű de hatékony módszer a detubulációs technika alkalmazása (Orchard et al. 2008), amely fizikailag lecsatolja a t-tubulus membránokat a sejtfelszíni membránokról. Ezen technika alkalmazásával a t-tubulusokban expresszált, regulációs funkcióval rendelkező NCX működése és a szubszarkolemmális térben a magas Ca-szint kialakulása meggátolható. Másrészt ezekkel a kísérletekkel modellezhető a szívelégtelenség progressziója során kialakuló t-tubulus dezorganizáció is (Ibrahim and Terracciano 2013). Fontos megjegyezni, hogy ezen kísérletek interpretációja nagymértékben támaszkodik a 2/ I és 2/ II pontok kísérleteinek eredményeire.

2/ IV. Az NCX gátlás hatása intakt szívizomsejtekben a globális és lokális Ca- és Na-szintek modulálása után

Ebben a szakaszban fizikai t-tubulus lecsatolás helyett különböző farmakológia ágensekkel fogjuk modulálni a szubszarkolemmális ionkoncentrációkat, melyek növelik vagy csökkentik a szubszarkolemmális Ca- és Na-szinteket. Alacsony koncentrációban a oubain szelektív módon gátolja a Na/K-pumpa t-tubulusokban expresszálódó izoformáját, s így lokálisan képes növelni a Na- és Ca szinteket (Despa et al. 2012, Swift et al. 2010). Az Anemona toxin-II és veratrin (Na-áram activátorok) eltérő módon növelik a lokális Na and Ca szinteket (Nagy et al. publication in preparation). Ezzel szemben a ranolazin és a tetrodotoxin alacsony koncentrációja (késői Na-áram gátlói) a lokális Na-szinteket csökkenteni fogják, s ezáltal a reverz NCX aktiválódását gátolják. Ezen farmakológiai beavatkozások megfelelő kombinációival különböző ionális konstitúciókat tudunk létrehozni intakt szívizomsejtekben, s így az NCX gátlás hatását különböző körülmények köztt tudjuk vizsgálni. Ezen kísérletek interpretációja szintén nagymértékben támaszkodik a 2/ I és 2/ II pontok kísérleteinek eredményeire.

Összefoglalva, kutatási tervünk tovább kívánja vizsgálni és karakterizálni az NCX-gátlás mint farmakológiai eszköz lehetséges hasznosíthatóságát, különös tekintettel a pozitív inotróp hatások lehetőségére, amely az NCX-gátlás egyéb kedvező hatásai (antiaritmiás hatás) mellett hasznos lehet a szívelégtelenség kezelésében. Kutatási tervünk újszerűségét az adja, hogy az NCX-et nemcsak mint eszenciális transzportert tekintjük a globális celluláris Ca-háztartásban, hanem az eredmények interpretációjába a t-tubulusokkal és a szubszarkolemmális Ca-mikrodoménekkel kapcsolatos, regulációs funkcióval rendelkező NCX modulálását is be kívánjuk vonni.



3. REFERENCES

Acsai K, Antoons G, Livshitz L, Rudy Y, Sipido KR. Microdomain [Ca²⁺] near ryanodine receptors as reported by L-type Ca²⁺ and Na+/Ca²⁺ exchange currents.
J Physiol 589:(10) pp. 2569-2583. 2011

Acsai K, Kun A, Farkas AS, Fülöp F, Nagy N, Balázs M, Szentandrássy N, Nánási PP, Papp JGy, Varró A, Tóth A. Effect of partial blockade of the Na(+)/Ca(2+)-exchanger on Ca(2+) handling in isolated rat ventricular myocytes.
Eur J Pharm 576:(1-3) pp. 1-6. 2007

Ago Y, Kawasaki T, Nashida T, Ota Y, Cong Y, Kitamoto M, Takahashi T, Takuma K, Matsuda T. SEA0400, a specific Na+/Ca2+ exchange inhibitor, prevents dopaminergic neurotoxicity in an MPTP mouse model of Parkinson's disease.
Neuropharmacology 61(8):1441-51. 2011

Amran MS, Homma N, Hashimoto K. Pharmacology of KB-R7943: a Na+-Ca2+ exchange inhibitor.
Cardiovasc Drug Rev. 21(4):255-76. Review. 2003

Bei F, Smith KJ. Axonal protection achieved by blockade of sodium/calcium exchange in a new model of ischemia in vivo.
Neuropharmacology. 63(3):405-14. 2012

Bers DM. Calcium fluxes involved in control of cardiac myocyte contraction. Circ Res, 87, 275-281, 2000.

Birinyi P, Acsai K, Bányász T, Tóth A, Horváth B, Virág L, Szentandrássy N, Magyar J, Varró A, Fülöp F, Nánási PP. Effects of SEA0400 and KB-R7943 on Na+/Ca2+ exchange current and L-type Ca2+ current in canine ventricular cardiomyocytes.
Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 372, 63-70, 2005.

Birinyi P, Toth A, Jona I, Acsai K, Almassy J, Nagy N, Prorok J, Gherasim I, Papp Z, Hertelendi Z, Szentandrassy N, Banyasz T, Fulop F, Papp JGy, Varro A, Nanasi PP, Magyar J. The Na+/Ca2+ exchange blocker SEA0400 fails to enhance cytosolic Ca2+ transient and contractility in canine ventricular cardiomyocytes
Cardiovasc Res 78:(3) pp. 476-484. 2008

Despa S, Islam MA, Weber CR, Pogwizd SM, Bers DM. Intracellular Na concentration is elevated in heart failure but Na/K pump function is unchanged. Circulation, 105, 2543-2548, 2002.

Despa S, Lingrel JB, Bers DM. Na+/K+-ATPase alpha 2-isoform preferentially modulates Ca2+ transients and sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in cardiac myocytes
Cardiovasc Res 95: (4) 480-486 2012

Eisner DA, Choi HS, Diaz ME, O'Neill SC, Trafford AW. Integrative analysis of calcium cycling in cardiac muscle. Circ Res, 87, 1087-1094, 2000.

Farkas AS, Acsai K, Nagy N, Tóth A, Fülöp F, Seprényi G, Birinyi P, Nánási PP, Forster T, Csanády M, Papp JGy, Varró A, Farkas A Na(+)/Ca(2+) exchanger inhibition exerts a positive inotropic effect in the rat heart, but fails to influence the contractility of the rabbit heart.
Br J Pharm 154:(1) pp. 93-104. 2008

Hobai IA, O'Rourke B. The potential of Na+/Ca2+ exchange blockers in the treatment of cardiac disease. Expert Opin Investig Drugs, 13, 653-664, 2004.

Ibrahim M, Terracciano CM. Reversibility of t-tubule remodeling in heart failure - mechanical load as a dynamic regulator of the t-tubules.
Cardiovasc Res. 2013 Jan 23. [Epub ahead of print]

Kamimura D, Ohtani T, Sakata Y, Mano T, Takeda Y, Tamaki S, Omori Y, Tsukamoto Y, Furutani K, Komiyama Y, Yoshika M, Takahashi H, Matsuda T, Baba A, Umemura S, Miwa T, Komuro I, Yamamoto K. Ca2+ entry mode of Na+/Ca2+ exchanger as a new therapeutic target for heart failure with preserved ejection fraction. Eur Heart J. 33(11):1408-16. 2012

Lee C, Visen NS, Dhalla NS, Le HD, Isaac M, Choptiany P, Gross G, Omelchenko A, Matsuda T, Baba A, Takahashi K, Hnatowich M, Hryshko LV. Inhibitory profile of SEA0400 [2-[4-[(2,5-difluorophenyl)methoxy]phenoxy]-5-ethoxyaniline] assessed on the cardiac Na+-Ca2+ exchanger, NCX1.1. J Pharmacol Exp Ther, 311, 748-57, 2004.

Lee C, Dhalla NS, Hryshko LV. Therapeutic potential of novel Na+-Ca2+ exchange inhibitors in attenuating ischemia-reperfusion injury. Can J Cardiol, 21, 509-516, Review, 2005.

Livshitz L, Acsai K, Antoons G, Sipido K, Rudy Y Data - Based Theoretical Identification of Subcellular Calcium Compartments and Estimation of Calcium Dynamics in Cardiac Myocytes.
J Physiol 590:(18) pp. 4423-4446. 2012

Nagy ZA, Virág L, Tóth A, Biliczki P, Acsai K, Bányász T, Nánási PP, Papp JGY, Varró A. Selective inhibition of sodium-calcium exchanger by SEA0400-0400 decreases early and delayed afterdepolarization in canine heart. Br J Pharmacol, 143, 827-831, 2004.

Niggli E. Measuring calcium in 'fuzzy' spaces.
J Physiol. 589 (Pt 11): 2663. 2011.

Orchard C, Brette F. T-tubules and sarcoplasmic reticulum function in cardiac ventricular myocytes.
Cardiovasc Res. 15;77(2):237-44. 2008

Ozdemir S, Bito V, Holemans P, Vinet L, Mercadier JJ, Varro A, Sipido KR Pharmacological inhibition of na/ca exchange results in increased cellular Ca2+ load attributable to the predominance of forward mode block.
Circ Res. 102(11):1398-405. 2008

Redfield MM. Heart failure – an epidemic of uncertain proportions. N Engl J Med; 347:1442–1444. 2002.

Saito R, Kaneko E, Tanaka Y, Honda K, Matsuda T, Baba A, Komuro I, Kita S, Iwamoto T, Takano Y.Involvement of Na+/Ca2+ exchanger in pentylenetetrazol-induced convulsion by use of Na+/Ca2+ exchanger knockout mice. Biol Pharm Bull. Nov;32(11):1928-30. 2009

Seki S, Taniguchi M, Takeda H, Nagai M, Taniguchi I, Mochizuki S. Inhibition by KB-r7943 of the reverse mode of the Na+/Ca2+ exchanger reduces Ca2+ overload in ischemic-reperfused rat hearts. Circ J, 66, 390-396, 2002.

Sipido KR, Varro A, Eisner D. Sodium calcium exchange as a target for antiarrhythmic therapy.
Handb Exp Pharmacol, 171, 159-199, Review, 2006.

Swift F, Tovsrud N, Sjaastad I, Sejersted OM, Niggli E, Egger M. Functional coupling of alpha(2)-isoform Na(+)/K(+)-ATPase and Ca(2+) extrusion through the Na(+)/Ca(2+)-exchanger in cardiomyocytes.
Cell Calcium. Jul;48(1):54-60. 2010

Takahashi T, Takahashi K, Onishi M, Suzuki T, Tanaka Y, Ota T, Yoshida S, Nakaike S, Matsuda T, Baba A. Effects of SEA0400, a novel inhibitor of the Na+/Ca2+ exchanger, on myocardial stunning in anesthetized dogs. Eur J Pharmacol, 505, 163-168, 2004.

Tanaka H, Nishimaru K, Aikawa T, Hirayama W, Tanaka Y, Shigenobu K. Effect of SEA0400, a novel inhibitor of sodium-calcium exchanger, on myocardial ionic currents. Br J Pharmacol, 135, 1096-1100, 2002.

Wang TJ, Evans JC, Benjamin EJ, Levy D, LeRoy EC, Vasan RS. Natural history of asymptomatic left ventricular systolic dysfunction in the community.
Circulation;108:977–982. 2003.

Watano T, Kimura J. Calcium-dependent inhibition of the sodium-calcium exchange current by KB-R7943. Can J Cardiol, 14, 259-262, 1998.

Required language skills: English
Further requirements: 
TDK munka

Number of students who can be accepted: 1

Deadline for application: 2017-03-15

 
All rights reserved © 2007, Hungarian Doctoral Council. Doctoral Council registration number at commissioner for data protection: 02003/0001. Program version: 1.2318 ( 2016. XI. 26. )