Login
 Forum
 
 
Thesis topic proposal
 
Béla Molnár
A colorectalis carcinomás betegek perifériás vér mRNS expressziós markereinek vizsgálata

THESIS TOPIC PROPOSAL

Institute: Semmelweis University, Budapest
clinical medicine
Doctoral School of Clinical Medicine

Thesis supervisor: Béla Molnár
Location of studies: Semmelweis Egyetem, II. sz. Belgyógyászati Klinika
Abbreviation of location of studies: SE


Description of the research topic:

Jelenlegi markerek:
Napjainkban a vastagbél rák diagnosztikájára széklet- és vérvizsgálatokat végeznek, de a jelenlegi markereknek a specificitása és szenzibilitása nem kielégítő.
A jelenlegi szűrési módszerek eltérőek. A leggyakrabban használt a székletből az occult vérzést mutatja ki (faecal occult blood test = FOBT). Ez 45 éves kortól évenkénti szűrést jelent. Erre kétféle módszert alkalmazhatnak. Az egyik a Guajak-próba, ennek használatát javasolják. Ez a haemoglobin pseudoperoxidáz aktivitásának kimutatásán alapszik. A széklettel történő vérvesztés fiziológiai mennyisége 0,5-1,5 ml/nap. Sajnos hamis pozitív eredményt is kaphatunk, ha a páciens peroxidázokban gazdag ételeket fogyasztott, pl.: friss zöldség, gyümölcs, nyers hús. Ezért ennek a tesztnek alacsony a specificitása (a sok hamis pozitív eredmény miatt) és alacsony a szenzitivitása (a sok hamis negatív eredmény miatt).
A másik módszer az occult vérzés kimutatására székletből a specifikus (immunkémiai) albumin vagy vérkimutatás. Ez érzékenyebb, ezért itt gyakrabban találkozunk pozitív eredménnyel kimutatható bélbetegség nélkül.
Napjainkban a széklet DNS vizsgálatok célja a k-ras és p53 gének kimutatása. Ennek szenzitivitása 58% felett van.
A multipanel DNS markerek (K-ras, APC, p53) a székletből történő kimutatásának szenzitivitása 64-91% között és szenzitivitása 93% van. Jelenleg ezeket a gén teszteket rutinszerűen Amerikában végezik.
DNS izolálás végezhető a szérumból vagy plazmából is és használható a vastagbélrák diagnosztikában.
K-ras, p53, APC, p16, BRAF gének mutációjának kimutatása lehetséges PCR-rel, DHPLC-vel és RFLP-vel. Ezeknek a vizsgálatoknak szenzitivitásuk 46 és 67% között van , specificitásuk 80 és 100% között.





Új lehetőség:
Egy új alternatív lehetőség lehet a colon biopsziás minta vizsgálatában és a diagnózis felállításában, ezzel a differenciáldiagnosztikában, prognózis és terápia megválasztásában a cDNS chipek.
A microarray technika egyedülálló lehetőséget nyújt a génexpressziók minőségi és mennyiségi analízisére, a génfunkciók értelmezésére, a génhibák kimutatására és a polimorfizmus kimutatására. Ezek használatával gyorsabb, pontosabb diagnosztikára tehetünk szert és ezekkel az eredményekkel a jövőben a személyre szabott, egyéni terápiát is felállíthatjuk. A microarray technológia az elmúlt 10 évben jelentős fejlődésen ment keresztül és egyre nagyobb szerepet játszik a molekuláris biológiai kutatásokban.
A jövőben lehetséges lehet hasonló elven alapuló diagnosztikus tesztek a vastagbél rák diagnosztikában.

Célkitűzés:
Vastagbéldaganatban szenvedők perifériás vér mRNS expressziós mintázatának felállítása teljes genom chipekkel diagnosztikai célból.

Munkafolyamat:
Vastagbél daganatos betegek perifériás vér mintáit PAXGENE csövekbe kell levenni, ez 4 csövet jelent páciensenként, amit -20 °C-on lehet tárolni.
Következő lépés a mintákból a total RNS szintézise és koncentrációja, ehhez 2 Kit-et használható fel: a PAXgene vér RNS Kit és a vér RNS koncentrációs Kit
Ennek a lépésnek minőségi és mennyiségi ellenőrzését kell elvégezni Nanodrop-pal és Bioanalyzer-rel.
A perifériás vér mintákból megtisztított celluláris RNS-sel az a probléma, hogy nagy mennyiségben tartalmaz globin traszkriptumokat, melyek csökkentik az expressziós analízis érzékenységét.
Ennek megoldására kell elvégezni a reverz transzkripció lépése alatt a globin redukciót. Ezzel a lépéssel globin-specifikus PNA oligonukleotidokat adunk a mintához, ezzel csökkenteni tudjuk a globin mRNS által létrehozott cDNS-ek mennyiségeket.
Hatékonyságának ellenőrzése szintén Bioanalyzer-rel végezhető.
A globin redukciót a T7 amplifikációval együtt a biotinált cRNS-ek szintézisekor alkalmazzuk.
Ekkor először egy egyszálú cDNS-t szintetizálunk meg reverz trabszkripcióval, majd egy két szálú cDNS-t és ebből T7 amplifikációval, biotinált nukleotidok beépítésével a jelölt cRNS-t.
Ezt követi a fragmentáció, ami után egy hibridizációs lépés jön. Ennél a jelölt mintákat 45 °C-on 16 órán át kell áramoltatni a chip felszínén.
A festést a mosások közé ékelve végezzük el. Erre a fluorescens fikoeritrint használhatunk, ami egy sztreptavidin kötésen keresztül kötődik a biotinhoz. A scanneléskor ezeket a kötéseket gerjesztjük lézerrel.
Ezt követi az adatok statisztikai analízise. Ezzel olyan gének kimutatása lehetséges, melyek szignifikáns különbséget mutatnak a daganatos és normál minták között felül- és alulexpresszióval.
A kapott eredményeket tehát összehasonlíthatjuk normál vagy egyéb vastagbél betegségekkel (pl.: adenoma, IBD). Így kimutathatók olyan gének, melyeknek szerepük lehet a daganatok kialakulásában.

Number of students who can be accepted: 3

Deadline for application: 2016-10-31

 
All rights reserved © 2007, Hungarian Doctoral Council. Doctoral Council registration number at commissioner for data protection: 02003/0001. Program version: 1.2318 ( 2016. XI. 26. )