Az immunválaszban résztvevő T regulációs sejtek, lymphocyta markerek és micro RNS vizsgálata gasztroenterológiai kórképekben (gyulladásos bélbetegség/IBD, coeliakia, alle
Thesis supervisor: Gábor Veres
Location of studies (in Hungarian): Semmelweis Egyetem, I. sz. Gyermekgyógyászati Klinika Abbreviation of location of studies: SE
Description of the research topic:
A gyulladásos bélbetegség (IBD) és az allergiás colitis pontos oka nem ismert, de bizonyos az, hogy a normálisan jelenlevő bélflóra elleni tolerancia elvesztésének kulcsfontosságú szerepe van. Ebben a folyamatban a T sejtes válasz gátlásával kapcsolatban háromféle CD4+ regulációs sejtnek van szerepe: Th3 - (TGF-beta produkció), Tr1 - (indukálható IL-10 termelés) és Treg sejteknek (FoxP3 és CD25 pozitivitás). A coeliakia pathomechanizmusa már jobban ismert, tudjuk a kiváltó faktort és az autoantigént. A kórkép mintául szolgálhat más immunmediált kórképek analízisében, a betegség lefolyását, természetét meghatározó faktorok felderítésében.
Kutatásunk döntően a T regulációs sejtek és egyéb lymphocyta markerek, iAP, valamint az apoptosis vizsgálatára irányul gyermekkori IBD-ben, allergias colitisben és coeliakiában. Eredményeinket felnőttkori mintákkal is tervezzük összehasonlítani, hiszen például IBD-ben a két kórkép genetikai, szerológiai és lokalizációs sajátosságai nem pontosan fedik egymást. Treg sejtek gátló funkciót töltenek be szervspecifikus autoimmun kórképekben (autoimmun thyreoiditis, gastritis, insulitis és arthritis), továbbá szervtranszplantációban gátolják a rejekciót. Ezen kívül szerepet játszanak az orális toleranciában, gátolják az enterális bélbaktériumok elleni T1 választ és állatkísérleti modellben (gyulladásos bélbetegség) jelentős anti-inflammatoricus aktivitásuk van. Utóbbi esetben kísérletes módon előidézett colitist CD4+CD25+ Treg sejtek adásával gyógyítani lehetett.
Kutatásunkban az IBD-s, coeliakiás- és allergias colitises gyermekek és felnőttek perifériás véréből és vastagbél-biopsziás mintáiból a Treg sejtek, iAL és az immunreakciókban ill. apoptosisban jelentős szerepet játszó lymphocyta markerek kimutatása flow-cytometria és immunhisztokémia segítségével történik. IBD-ben szenvedő gyermekek (18 éves korig) és felnőttek 2-2 különböző csoportjait (új betegek, kezelést még nem kap; relapszusban levő) vizsgálnánk, valamint olyan coeliakiásokat, akik még nem diétáznak, majd 6 hónappal a diétát követően. Hasonlóan hematokezias allergiás colitises csecsemőkben a terápiás válasz előtt és után is történne az összehasonlító elemzés. Egy adott beteganyagban az IBD aktivitásának megfelelően 2 csoportot vizsgálnánk: frissen kórismézett-gyógyszert még nem szedő és aktív-relapszusban levő IBD-s beteg. Mindkét csoportban az aktív szakot követően 1 hónappal kontroll vizsgálat történne, a remisszóba (ha az alkalmazott terápia mellett sikerül) kerülés elemzésére. Valamennyi beteg IBD aktivitásának számszerű értékelése (IBD activity score) rögzítésre kerül mindkét időben (1. vizsgálat és egy hónappal később a második vizsgálat), így később a kapott eredményeket pontosan össze lehet vetni az adott beteg aktivitási indexével. Fontos kiemelni, hogy friss, kezeletlen IBD-s gyermekek átfogó vizsgálata az irodalmi adatok szerint még nem történt meg, egyrészt ezek a páciensek alkotnák az egyik fontos populációt, másrészt ezeket a betegeket lineárisan követnénk, az első, még kezelés előtti analízis után egy hónappal később a remisszióba kerüléskor is vizsgálnánk a különböző paramétereket. A betegek aktivitási indexét korreláltatnánk a Treg sejtek és a vizsgált egyéb paraméterek értékeivel.
Flow-citométer alkalmazásával a Treg sejteket CD4+CD25+ jelölésük alapján azonosítjuk, majd jelenlétüket az intracelluláris FoxP3 transzkripciós faktor kimutatásával igazoljuk. A Th1-Th2 polarizáltságot a CD4+ T sejtek intracelluláris citokin-milliőjének analizálásával határozzuk meg. Ezen kívül a felszíni festés révén elkülönített különböző fehérvérsejt-csoportok (CD3+, CD4+, CD8+ stb.) és sejtfelszíni markerek karakterizálását (CD25/IL-2, CD45, CD45RO, CD45RA, Annexin) is elvégezzük. A kapott eredményeket hasonlítanánk össze az adott betegség (IBD, coeliakia, allergia) kiindulási- és a már kezelt- (immunszuppresszív terápia, gluténmentes diéta, eliminációs étrend), valamint a kontrollok értékeivel.
Immunhisztokémiai vizsgálatokkal a kolonoszkópia során eltávolított biopsziás mintákban analizálnánk a Treg sejteket, Th1 és Th2 citokineket, iAP és az adatokat összevetjük a perifériás vérminták fentebb ismertetett flow-citometriás értékeivel.
Ezen kívül az IBD-s gyermekek ileum és colon-biopsziás mintáiból iAP-expresszió és aktivitás mérését, villinexpressszió, (TLR4 detektálása), TLR4-LPS interakció detektálását és LPS enzim detektálást tervezzük. Továbbá az IBD-s gyermekek perifériás vérmintáiban szeretnénk megvizsgálni az iAP-szinteket.
Várható eredmény
A Treg sejteket, az adaptív immunitást meghatározó paramétereket gyermekkori IBD-ben, coeliakiában, allergiás colitisben részleteiben korábban nem vizsgálták, nem történt összehasonlító elemzés a felnőtt betegek adataival sem. A csekély számú publikáció eredményei ellentmondóak, frissen kórismézett IBD-s betegekben még nem történtek kiterjedt összehasonlító elemzések. Vizsgálatainktól éppen azt várjuk, hogy az újonnan kórismézett, gyógyszert még nem kapó IBD-s mintákban milyen mértékű a Treg sejtek jelenléte, valamint ezeknek a sejteknek a jelenléte hogyan változik a betegség lefolyása során, vagyis milyen a szabályozás dinamikája. Ezen tényezők ismerete nem csak diagnosztikus, hanem esetleg terápiás konzekvenciával is járhat, hiszen állatkísérletes IBD modellben a Treg sejtek szupplementációjával a colitist gyógyítani lehetett. A különböző lymphocyta sejtfelszíni markertek, apoptosisban fontos szerepet kapó molekulák és kemokinek analízisével a Treg sejtek szabályozásának körülményei is feltérképezhetők.
Login
